【 摘要】

目的 比較3D打印和計(jì)算機輔助設計(jì)與制造(CAD/CAM)氧化锆種植體(tǐ)與純钛種植體(tǐ)在動物體(tǐ)内的骨結合和成骨效果的差異，評價氧化锆種植體(tǐ)骨結合性能。

【 方法 】

分(fēn)别将3D打印氧化锆、CAD/CAM 種植體(tǐ)和钛種植體(tǐ)各20枚随機植入6隻Beagle犬的胫骨内，8周後觀察氧化锆種植體(tǐ)的成功率和骨結合能力，并與钛種植體(tǐ)進行比較，觀察指标爲種植體(tǐ)的成功率、反向扭矩值、骨接觸率和種植體(tǐ)周圍骨密度。數據采用單因素方差分(fēn)析( ANOVA) 進行比較。

【結果】

3組種植體(tǐ)的成功率均爲100%。CAD/CAM氧化锆種植體(tǐ)組的反向轉矩值均大(dà)于35N•m；3D 打印氧化锆種植體(tǐ)組的反向轉矩值均大(dà)于35N•m; 钛種植體(tǐ)組中2顆種植體(tǐ)的反向轉矩值爲20~35N•m，8顆種植體(tǐ)的反向轉矩值大(dà)于35N•m。組織學觀察：3D打印氧化锆種植體(tǐ)、CAD/CAM氧化锆種植體(tǐ)和純钛種植體(tǐ)的不含骨髓腔骨結合率分(fēn)别爲(66.35±6.64)%、(61.32±10.41)%和(58.88±25.10)%，含骨髓腔骨結合率分(fēn)别爲(49.57±5.04)%、(42.21±18.58)%和(38.45±23.27)%，平均骨結合率分(fēn)别爲(58.94±6.31)%、(53.56±8.77)%和(48.31±20.76)%，種植體(tǐ)周圍骨密度分(fēn)别爲(60.59±7.31) %、(58.50±6.36)%和(58.18±14.80)%，差異無顯著性(P＞0.05) 。

【結論】

氧化锆種植體(tǐ)與純钛種植體(tǐ)的骨結合能力相(xiàng)當，能形成緊密的直接骨接觸，因此氧化锆種植體(tǐ)有望成爲口腔種植體(tǐ)的可(kě)選材料。

【關鍵詞】

骨結合；氧化锆種植體(tǐ)；不脫鈣種植體(tǐ)骨切片。

钛種植體(tǐ)雖然因良好的“骨結合”［1］性能被廣泛應用［2－3］，但(dàn)也會因金屬過敏或美學問題而被限制應用［4］。随着數字化技術與修複技術緊密結合，氧化锆種植修複有了技術突破［5－6］。本研究已建立氧化锆種植體(tǐ)的三維模型［7］，并制造3D打印氧化锆種植體(tǐ)和計(jì)算機輔助設計(jì)與制造(computer aided design ＆ computer assomated manufacture，CAD/CAM) 氧化锆種植體(tǐ)。

爲了氧化锆種植體(tǐ)能夠達到與BEGO钛種植體(tǐ)TiPurePlus 相(xiàng)當的表面粗糙度(粗糙度Ra= 1～2μm)［8－9］，預先對其表面進行噴砂和加熱(rè)酸蝕處理(lǐ)。采用硬組織切片技術和反向轉矩實驗，比較兩組氧化锆種植體(tǐ)與某公司純钛種植體(tǐ)的成功率、骨結合率、種植體(tǐ)周骨密度和反向轉矩值，評價氧化锆種植體(tǐ)骨結合性能［10］。

01材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要儀器Exakt510 脫水儀、Exakt520 光固化包埋機、Exakt 300CP 切片機、Exakt 400CS 磨片機(EXAKT公司，德國(guó))，光學顯微鏡(Olympus公司，日(rì)本) 。

1.1.2 手術器械NSK種植機(NSK公司，日(rì)本)，種植器械盒(Thommen Medical AG，瑞士) ，手術刀柄，刀片，持針器骨膜剝離(lí)器，血管鉗，組織剪，1号絲線，巾鉗，鋪巾。

1.1.3 實驗藥物速眠新(聖達動物藥品有限公司，中國(guó))，3%戊巴比妥鈉(科(kē)豐化學試劑有限公司，中國(guó)) ，注射用青黴素鈉(華北制藥股份有限公司，中國(guó)) ，多聚甲醛溶液、亞甲基藍、酸性品紅(hóng)、高錳酸鉀、苦味酸、磷酸氫二鈉(豪普斯生(shēng)物技術有限公司，中國(guó)) 。

1.1.4 種植體(tǐ)根據實驗目的分(fēn)爲3組。

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實驗組1: 經過表面處理(lǐ)的3D打印氧化锆種植體(tǐ)20枚(昆山(shān)博力邁三維打印科(kē)技有限公司) (圖1A) ;

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實驗組2: 經過表面處理(lǐ)的CAD/CAM 氧化锆種植體(tǐ)20枚(杭州口腔醫院)(圖1B) ;

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實驗組3: 某知名公司提供純钛超親水種植體(tǐ)20枚(上海宇井貿易有限公司)。

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所有種植體(tǐ)直徑3.5mm，長度8mm，穿龈2mm，基台高度4mm。

A: 3D 打印；B: CAD/CAM制作

圖1 實驗用一段式氧化锆植體(tǐ)

Fig.1 One-stage zirconia implant for experiment

1.2 實驗方法

1.2.1 兩組氧化锆種植體(tǐ)植入前表面處理(lǐ)3D打印氧化锆種植體(tǐ)和CAD/CAM氧化锆種植體(tǐ)植入前采用顆粒尺寸爲250μm 的Al2O3粒子，噴砂力度0.8MPa，距離(lí)18mm，垂直噴砂4個循環，40%氫氟酸60℃酸蝕60min，蒸餾水超聲震蕩幹燥後采用掃描電鏡對3D打印氧化锆種植體(tǐ)和CAD/CAM氧化锆種植體(tǐ)表面形貌進行顯微觀察。

1.2.2 實驗動物及模型制作實驗動物成年(nián)雄性健康的Beagle犬共6隻，15個月齡，質量爲16～17kg。實驗動物使用許可(kě)證号: SYXK(浙)2018-0012。使用動物質量合格證明編号: 201807863。動物種植體(tǐ)植入手術及飼養均在浙江中醫藥大(dà)學動物實驗中心進行，所有實驗動物在手術前均在籠子中隔離(lí)飼養1周。

将60枚植體(tǐ)編号1～60号，按随機分(fēn)配的原則(随機數字表)植入6隻Beagle犬的胫骨中，每隻Beagle犬每側胫骨植入5枚種植體(tǐ)。全麻前準備:術前禁食12h；術前0.5h肌注青黴素鈉80萬U以預防感染。種植手術：氣管插管下，速眠新(0.04～0.08mg/kg) 對Beagle犬進行後腿肌肉注射。全麻起效後，常規消毒鋪巾，後腿阿替卡因1.7mL浸潤麻醉，切開、翻瓣、暴露胫骨外側，逐級預備種植窩，植入種植體(tǐ)，安放(fàng)愈合帽。對位縫合創口，種植術後即刻拍(pāi)攝X線片，觀察植入位置、角度(圖2)。術後常規抗感染處理(lǐ)。

圖2 種植術後即刻拍(pāi)攝X 線片

Fig.2 X-rays taken immediately after implantation

1.2.3 标本處理(lǐ)在8周時，取3組種植體(tǐ)各10枚進行反向扭矩測試，将扭力扳手與種植體(tǐ)垂直相(xiàng)接，緩慢(màn)擰出種植體(tǐ)，扭力扳手刻度顯示将種植體(tǐ)擰松的扭力值即爲旋出扭力峰值。随後處死Beagle犬，将帶有種植體(tǐ)的胫骨整段鋸下(圖3)，生(shēng)理(lǐ)鹽水反複沖洗，固定後制備不脫鈣硬組織切片。

圖3 帶有種植體(tǐ)的整段胫骨

Fig.3 Entire tibia with implants

1.2.4 不脫鈣種植體(tǐ)骨切片的制備和染色用4%的甲醛固定浸泡，4℃冰箱保存72h，然後用70%乙醇溶液浸泡。修整帶種植體(tǐ)的标本，标本大(dà)小約5mm×15mm×10mm，在Exakt510 脫水儀中使用70%～100%的乙醇溶液梯度脫水，在Exakt520光固化包埋機中進行樹脂浸透包埋和聚合(圖4)。完成聚合反應後，準備A、B 兩張載玻片，用Technovit 4000粘接劑把标本包埋塊粘合于載玻片A上，将載玻片A吸附于切片機夾具上，修整組織塊，使用Exakt 400CS 磨片機對标本表面進行抛光，然後用Technovit-7210VLC膠水将載玻片B粘合于标本的抛光面側，形成兩側載玻片、中間組織塊的雙夾結構。将載玻片A吸附在Exakt 300 CP a切片機夾具上，将切割厚度設定爲150～200μm，切下載玻片B側約150μm厚的切片，使用SiC和Al2O3砂紙自(zì)動磨片，設置厚度爲30μm，再用細砂紙進行切片表面抛光，最終制作出厚度約爲30μm的光滑種植體(tǐ)骨磨片。将切磨好的骨切片使用雙蒸水進行超聲清洗10min，自(zì)然幹燥後用亞甲基藍－酸性品紅(hóng)色，樹脂封片。

圖4 樹脂浸透包埋塊

Fig.4 Resin impregnated embedded block

1.2.5 圖像分(fēn)析/光學觀察及骨接觸率測定在光學顯微鏡下觀察并采集圖像，結合圖像處理(lǐ)軟件(Image-Pro Plus6.0)進行測量并根據骨接觸率(bone-to-implant contact，BIC)和種植體(tǐ)周圍骨密度(bone density，BD)公式計(jì)算，得(de)到兩組氧化锆種植體(tǐ)和某知名公司純钛組種植體(tǐ)的不含骨髓腔骨結合率、含骨髓腔骨結合率、平均骨接觸率和種植體(tǐ)周圍骨密度。骨接觸率(不含骨髓腔)=骨皮質、骨松質與種植體(tǐ)螺紋實際接觸的長度之和/種植體(tǐ)螺紋植入骨皮質、骨松質的長度×100%；骨接觸率(含骨髓腔)=骨髓腔與種植體(tǐ)螺紋實際接觸的長度之和/種植體(tǐ)螺紋植入骨髓腔内的長度×100%；平均骨接觸率=骨與種植體(tǐ)實際接觸長度之和/種植體(tǐ)螺紋植入骨組織内的長度×100%；種植體(tǐ)周圍骨密度(BD)=骨結合區域/整個結合區域×100%［11］，測量方法爲在螺紋端上放(fàng)置一條切線，計(jì)算該切線與槽内種植體(tǐ)輪廓之間的像素。

1.3 統計(jì)學處理(lǐ)

采用SPSS17.0軟件包對所有實驗數據處理(lǐ)。進行統計(jì)學處理(lǐ)後的數據以(X的平均值±s)表示。數據采用單因素方差分(fēn)析(ANOVA)進行比較，P＜0.05表示差異有顯著性。

02 結 果 

2.1 兩組氧化锆種植體(tǐ)表面處理(lǐ)後掃描電鏡觀察結果見圖5～6，可(kě)見經噴砂+酸蝕後的氧化锆表面形成均勻的粗化效果。3D打印組表面大(dà)孔徑12～17μm，小孔徑1.1～2.6μm。經噴砂+酸蝕後的CAD/CAM組表面大(dà)孔徑18～21μm，小孔徑1.0～2.6μm。

A：表面大(dà)孔徑爲12～17μm(×1000)；B：小孔徑爲1.1～2.6μm(×10000)

圖5 3D打印種植體(tǐ)(實驗組1)表面電鏡觀察

Fig.5 Surface electron microscopy of 3D printed implants (Experimental group 1)

 A：表面大(dà)孔徑爲18～21μm(×1000)；B：小孔徑爲1.0～ 2.6μm(×10000)

圖6 CAD/CAM 種植體(tǐ)( 實驗組2) 表面電鏡觀察

Fig.6 Surface electron microscopy of CAD/CAM implants (Experimental group 2)

2.2 影(yǐng)像學觀察結果

術後離(lí)體(tǐ)的Beagle犬胫骨經便攜式X線機拍(pāi)照(zhào)，得(de)到種植體(tǐ)植入的骨界面愈合情況(圖7) 。種植體(tǐ)和周圍骨組織嵌合緊密無間隙存在，螺紋均位于骨平面以下，光滑面均位于胫骨骨皮質外，植體(tǐ)植入方向與骨面垂直，植體(tǐ)之間的間距在2～3 mm，植體(tǐ)周圍未見異常透射影(yǐng)像。三組種植體(tǐ)的成功率均爲100%。

圖7 種植體(tǐ)植入的骨界面愈合情況

Fig.7 Healing of bone interface after implantation

2.3 反向轉矩值統計(jì)

3D打印氧化锆種植體(tǐ)組及CAD/CAM氧化锆種植體(tǐ)組的反向轉矩值均大(dà)于35N•m；钛種植體(tǐ)組中2顆爲20～35N•m，8顆大(dà)于35N•m。

A：3D打印氧化锆種植體(tǐ)；B：CAD/CAM氧化锆種植體(tǐ)；C：純钛種植體(tǐ)；密質骨、編織骨、類骨質、纖維軟組織分(fēn)别呈深紫色、淺紫色、藍色、深藍色；3D打印種植體(tǐ)、CAD/CAM氧化锆種植體(tǐ)、純钛種植體(tǐ)分(fēn)别呈黃(huáng)棕色、黑(hēi)色

圖8 種植術後8周不脫鈣種植體(tǐ)骨切片經亞甲基藍酸性品紅(hóng)染色的光學顯微鏡圖像

Fig.8 Optical microscope image of the undecalcified implants stained with methylene blue acid fuchsin at the 8th week after implantation

2.4 亞甲基藍－酸性品紅(hóng)染色、骨接觸率測定(圖8)爲種植體(tǐ)植入8周後，3D打印氧化锆種植體(tǐ)、CAD/CAM氧化锆種植體(tǐ)和純钛種植體(tǐ)的亞甲基藍酸性品紅(hóng)染色圖。亞甲基藍酸性品紅(hóng)染色可(kě)清晰顯示新舊骨組織邊界和成骨細胞，便于區分(fēn)軟硬組織。圖中可(kě)看(kàn)到紫紅(hóng)色的是骨小梁，藍色的是間質。新生(shēng)的編織骨較疏松，染色較深紫色；密質骨爲淺紫色，骨小梁間的纖維網狀結構爲淺藍色，纖維軟組織呈深藍色，藍色爲類骨質。另外，位于螺紋表面可(kě)以看(kàn)到較粗的新生(shēng)骨小梁。3組種植體(tǐ)不含骨髓腔骨結合率、含骨髓腔骨結合率、平均骨接觸率和種植體(tǐ)周圍骨密度數值如(rú)(表1)所示，差異均無顯著性(P＞0.05)。

03 討(tǎo) 論 

評價種植體(tǐ)骨結合性能的方法主要有影(yǐng)像學檢查、旋出扭力法、硬組織切片技術等。本研究選擇Beagle犬作爲實驗動物模型來(lái)評價種植體(tǐ)的骨結合性能，結合自(zì)身(shēn)實驗條件，選擇X線牙片縱向觀察種植體(tǐ)骨界面愈合情況、種植體(tǐ)旋出扭矩、種植體(tǐ)骨接觸率、種植體(tǐ)周圍骨密度等指标來(lái)比較3D打印氧化锆種植體(tǐ)、CAD/CAM氧化锆種植體(tǐ)、純钛種植體(tǐ)的骨結合性能。

本實驗采用X線片方法，觀察種植體(tǐ)植入術後8周的骨界面愈合情況，結果顯示3組标本均未發現種植體(tǐ)周圍異常透射影(yǐng)像，植體(tǐ)植入的三維位置與相(xiàng)互距離(lí)均正确，表明實驗動物模型成功建立。

旋出扭力法屬破壞性實驗，會使種植體(tǐ)的骨結合産生(shēng)不可(kě)逆的損傷，所以臨床應用受到限制。但(dàn)其仍是動物實驗中評價骨結合程度的重要方法，一般采用數字扭力測試儀測量并記錄種植體(tǐ)骨結合被破壞時的扭力峰值，間接評價骨結合的狀況。Sullivan 等［12］通過臨床研究，将20N•m 的扭力阈值作爲種植體(tǐ)骨結合成功的标準。本實驗使用扭力扳手測量旋出扭矩峰值，結果顯示種植體(tǐ)植入術後8周以後，3組種植體(tǐ)扭力峰值均大(dà)于20N•m，提示各組種植體(tǐ)均能形成良好的骨結合，可(kě)認爲是成功骨結合的标準［13］。

不脫鈣種植體(tǐ)骨切片技術因其可(kě)以保存骨組織的細微結構，已被廣泛用于種植體(tǐ)骨結合的形态學研究。主要的骨形态計(jì)量學參數有骨接觸率和種植體(tǐ)周圍骨密度。骨接觸率和種植體(tǐ)周圍骨密度主要反映種植體(tǐ)周圍新骨形成的量，這個量很難達到100%［14］。文獻報道氧化锆種植體(tǐ)的BIC爲27.1%～74.0%［15－16］，純钛種植體(tǐ)的BIC爲23.2%～83.7%［17－18］，一般認爲大(dà)于50%爲适宜的骨結合率［19］。并且所有研究均顯示，同一觀察時間點氧化锆種植體(tǐ)和钛種植體(tǐ)BIC差異無統計(jì)學意義。本研究植入8周時的組織學結果顯示，3 組樣本的平均骨接觸率均達到48%以上，種植體(tǐ)周圍骨密度均在58%以上，均可(kě)獲得(de)良好的初期穩定性，并且3組骨接觸率和種植體(tǐ)周圍骨密度的差異無顯著性。基于本研究的結果可(kě)得(de)出，3D打印氧化锆種植體(tǐ)、CAD/CAM氧化锆種植體(tǐ)和純钛種植體(tǐ)可(kě)達到相(xiàng)似且良好的骨結合程度，此結果和Stenlund、王曉娜等的研究結果一緻［20－21］。