§ 來(lái)源：中國(guó)知網

§ 作者：朱福餘 林振華 孫立魁 車國(guó)喜 屈秋錦 劉香東 劉增祥 劉成虎△

（山(shān)東省醫療器械和藥品包裝檢驗研究院 國(guó)家藥品監督管理(lǐ)局生(shēng)物材料器械安全性評價重點實驗室 山(shān)東 濟南(nán) 250101）

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【摘要】

目的：建立植入了骨修複材料小型豬腰椎椎體(tǐ)骨組織标本的不脫鈣病理(lǐ)組織切片制備方法。方法：将含骨修複材料的腰椎椎體(tǐ)骨組織标本進行分(fēn)割暴露組織切面，梯度濃度乙醇脫水後經 Technovit 7200 VLC 光聚樹脂浸潤，經黃(huáng)藍光共同輻照(zhào)進行光聚合包埋，借助硬組織病理(lǐ)切磨系統制備含骨修複材料不脫鈣病理(lǐ)組織切片。結果：結果顯示通過上述方法制備的病理(lǐ)組織切片，經蘇木精 - 伊紅(hóng)（HE）染色及甲苯胺藍染色後光學顯微鏡下觀察能較好地顯示骨的各種組織細胞結構，可(kě)清晰的觀察到骨小梁的走向及連接情況。結論：研究建立了含骨修複材料骨組織标本病理(lǐ)組織切片制備方法，實現了含骨修複材料不脫鈣骨組織病理(lǐ)切

片的制備，經病理(lǐ)染色後實現了帶植入物的組織學觀察，爲生(shēng)物材料及醫療器械動物試驗研究提供了新的病理(lǐ)檢測手段及組織學評價途徑。

關鍵詞：小型豬腰椎椎體(tǐ)；含骨修複材料骨組織标本；樹脂包埋法；不脫鈣病理(lǐ)組織切片制備

中圖分(fēn)類号：R-33；R318.08 文獻标識碼：A 文章(zhāng)編号：1673-6273（2023）06-1017-05

【前言】

用于骨修複的生(shēng)物材料及器械在進行臨床試驗前均需要進行臨床前安全性和有效性動物試驗研究，以預測其應用于臨 床可(kě)能發生(shēng)的不良作用[1，2]。骨修複材料的動物試驗研究需要制備合适的骨缺損動物模型，将骨修複材料植入到制備的骨缺損區域，評價骨缺損部位的局部炎症反應、骨整合程度、骨重建情況，對該骨修複材料的安全性及有效性進行評價[3，4] 。生(shēng)物材料及醫療器械動物試驗周期結束後，需要剖檢、取樣，切取連帶植入物及其周邊骨組織進行病理(lǐ)組織切片制備，以觀察生(shēng)物材料及醫療器械與宿主骨組織結合界面的結合情況及其在動物體(tǐ)内的吸收降解情況 。與普通的石蠟包埋組織切片制備方法相(xiàng)比，埋置有植入物的骨組織标本進行組織切片制備時采用樹脂包埋病理(lǐ)組織切片制備方法不需要進行脫鈣處理(lǐ)，不需要額外剔除組織内埋置的植入物，可(kě)完整的觀察到植入物與宿主骨組織結合界面的組織反應情況，實現對植入物與骨組織結合界面組織細胞學變化的研究。本研究對植入了骨修複材料小型豬腰椎椎體(tǐ)不脫鈣病理(lǐ)組織切片制備方法進行了研究，以期能爲相(xiàng) 關研究人(rén)員提供參考。

01材料與方法

1.1 材料1.1.1 組織标本 按照(zhào)《醫療器械動物試驗研究注冊審查指導 原則 第二部分(fēn)：試驗設計(jì)、實施質量保證（2021 年(nián)第 75 号）》進行骨修複材料産品安全性和有效性評價動物試驗研究方案的設計(jì)與實施[5]。試驗研究制備小型豬腰椎椎體(tǐ)骨缺損動物模型， 将委托方提供的骨修複材料植入到制備的缺損部位，動物試驗研究周期結束後獲得(de)了植入了骨修複材料的腰椎椎體(tǐ)骨組織标本。1.1.2 主要試劑及儀器設備 主要試劑：10 %中性福爾馬林溶 液（購(gòu)自(zì)濟南(nán)百博生(shēng)物技術股份有限公司），無水乙醇（購(gòu)自(zì)國(guó)藥集團化學試劑有限公司），蘇木精染液、伊紅(hóng)染液及甲苯胺藍染色試劑盒（購(gòu)自(zì)北京索萊寶科(kē)技有限公司），Technovit 7200 光聚樹脂（購(gòu)自(zì)德國(guó) EXAKT 公司）。主要儀器設備：E300CP 型 硬組織切片機、E400CS 型 硬組織磨片機、E402 型 平行粘片裝置、E510 型脫水浸潤儀、E520 型光固化包埋機、 E530 型 幹燥滲透聚合裝置、E312 型 骨組織病理(lǐ)切割機（德國(guó) EXAKT 公司）。1.2 方法1.2.1 組織标本的固定将切取下的小型豬椎體(tǐ)骨組織标本 放(fàng)入 10 %中性福爾馬林溶液中進行固定，固定 24 h 後，更換新 的 10 %中性福爾馬林溶液，進一步繼續固定，固定時間不少于 1 周。1.2.2 組織标本的切割取材 将充分(fēn)固定後的骨組織标本借 助 E312 型骨組織病理(lǐ)切割機切割爲約 7 mm 厚度的标本，置 于 10 %中性福爾馬林溶液中繼續固定至少 12 h ，流水沖洗至 少 1 h，以水置換出組織中滲透的固定液。1.2.3 組織标本的脫水及浸潤 在抽真空條件下将固定充分(fēn)經流水沖洗後的骨組織标本逐級浸入梯度乙醇進行脫水處理(lǐ)， 脫水程序見表 1 。在抽真空條件下将脫水完全的骨組織标本逐 級浸入不同體(tǐ)積比的 Technovit 7200VLC 樹脂 / 乙醇混合液中 進行浸潤處理(lǐ)，浸潤程序見表 2。

1.2.4 組織标本的光固化包埋聚合 取出浸潤完全的骨組織标本置入光固化包埋專用的模具中，加入光聚樹脂，借助 EX- AKT 530 幹燥滲透聚合裝置進行抽真空處理(lǐ)，排淨包埋模具内 殘存的氣泡後進行固化聚合操作。固化過程由低強度的黃(huáng)光與高強度的藍光共同輻照(zhào)完成 ，先黃(huáng)光輻照(zhào) 6 h 後藍光輻照(zhào) 8 h 完成骨組織标本的光固化聚合。含骨修複材料的腰椎椎體(tǐ)骨組織标本光固化包埋标本塊，見圖 1。

1.2.5 組織标本的平行粘片制作将聚合過的組織标本樹脂 包埋塊從(cóng)包埋模具中取出 ，利用 Technovit4000 粘合劑套裝将 包埋有骨組織的樹脂包埋塊黏于載玻片上。經 EXAKT 300 CP 硬組織切片機切割 ，暴露出需要的組織切面 ，利用 EXAKT 400CS 硬組織磨片機對切面進行抛光處理(lǐ) ，另取一張載玻片， 在 EXAKT 402 載片黏合裝置上用 Technovit 7210VLC 精密粘合劑将該載玻片黏附于标本塊的抛光面，組織标本的平行粘片即制作完成。

1.2.6 組織标本的切片及磨片 經 EXAKT 300CP 硬組織切 片機将包埋有組織标本的樹脂塊進行切割，一般将切割厚度設 爲 200-300 μm，切片完成後，取下切片，經 EXAKT 400CS 硬組 織磨片機進行磨片操作，磨片過程中要用到不同規格的研磨紙和抛光紙，先進行粗磨，再進行精磨，最後進行抛光處理(lǐ)，将組織磨至 20 μm 左右 。含骨修複材料的腰椎椎體(tǐ)骨組織标本切磨片，見圖 2。

1.2.7 含骨修複材料組織切片的染色将制備的含骨修複材 料的組織切磨片經蒸餾水充分(fēn)清洗後，進行病理(lǐ)染色 。含骨修複材料腰椎椎體(tǐ)骨組織病理(lǐ)切片 HE 染色方法：蘇木精染液 30 min，自(zì)來(lái)水充分(fēn)沖洗，1 %鹽酸乙醇分(fēn)化 30 s，流水沖洗後再入溫水返藍，置伊紅(hóng)染色液 5 min，自(zì)來(lái)水沖洗，待組織切片自(zì)然幹燥後經 Technovit 7200VLC 封片後，置光學顯微鏡下鏡檢觀察。含骨修複材料腰椎椎體(tǐ)骨組織病理(lǐ)切磨片甲苯胺藍染色方 法：将制備的骨組織标本病理(lǐ)切磨片置于體(tǐ)積分(fēn)數 1 %甲苯胺 藍染液中 20 min 後，自(zì)來(lái)水充分(fēn)沖洗，待組織切片自(zì)然幹燥後 經 Technovit 7200VLC 封片後，置光學顯微鏡下鏡檢觀察。02    結果      

2.1 制備的含骨修複材料小型豬腰椎椎體(tǐ)不脫鈣骨組織病理(lǐ)切片 HE 染色結果通過上述方法制備了含骨修複材料小型豬腰椎椎體(tǐ)不脫鈣骨組織病理(lǐ)切片，經 HE 染色後，光學顯微鏡下觀察可(kě)見試驗研究植入的骨修複材料，呈淺灰色 。組織切片經 HE 染色後 細胞核呈藍色，胞質呈紅(hóng)色，胞核、胞質着色對比鮮明，骨組織細胞未見移位變形，可(kě)清晰辨認骨的各種細胞成份，實現了含植入物不脫鈣骨組織的組織細胞學觀察，見圖 3。

2.2 制備的含骨修複材料小型豬腰椎椎體(tǐ)不脫鈣骨組織病理(lǐ)切片甲苯胺藍染色結果含骨修複材料小型豬腰椎椎體(tǐ)不脫鈣骨組織病理(lǐ)切片經 甲苯胺藍染色後，光學顯微鏡下觀察可(kě)見試驗研究植入的骨修複材料，呈淺灰色 。組織細胞經甲苯胺藍染色後，能較好地顯示骨的各種組織細胞結構 ，可(kě)清晰的觀察到骨小梁的走向及連接情況，可(kě)以觀察到植入的骨修複材料與宿主骨結合情況， 見圖 4。

03    討(tǎo)論     

骨組織标本采用石蠟包埋法進行病理(lǐ)切片制作時，必須先用乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、硝酸、甲酸等脫鈣液對骨組織标本進行脫鈣處理(lǐ)[6-8]。在骨組織内埋置有植入物的情況下石蠟包埋組織切片并不适用 ，原因是硬化後的石蠟雖具有一定的硬度，但(dàn)其硬度不足以支撐去(qù)切組織内包埋的植入物，切片過程會造成蠟塊碎裂[9-11]。

樹脂包埋法制備病理(lǐ)組織切片與常規 " 石蠟包埋組織切 片 " 相(xiàng)比，制片步驟更爲複雜繁瑣，制片周期更長，組織标本需 要曆經組織切割暴露切面、梯度乙醇脫水、不同體(tǐ)積比的 Tech- novit 7200VLC 樹脂 / 乙醇混合液浸潤、光聚合包埋、制備平行 粘片，切片、磨片，才可(kě)制備出一張不脫鈣的骨組織病理(lǐ)切片。上述報道的骨組織病理(lǐ)切片制備方法所适用的病理(lǐ)染色方法 少，這是其缺陷所在，造就(jiù)了适用範圍受限 。同時，這種方法制 備病理(lǐ)切片周期長 ，僅組織标本的浸潤處理(lǐ)過程就(jiù)需要近 40 天 。其優點是骨組織制片過程中不需要脫鈣處理(lǐ)，組織在埋置 有植入物的情況下，不需要剔除植入物，這是 " 石蠟包埋組織 切片 " 所實現不了的，上述報道的骨組織病理(lǐ)切片制備方法可(kě) 作爲傳統的 、經典的 " 石蠟包埋組織切片技術方法 " 的補充。利用該技術方法制備含骨修複材料腰椎椎體(tǐ)不脫鈣病理(lǐ)組織切片時，需注意以下細節：（1）若切取的骨組織标本體(tǐ)積較大(dà)， 應延長固定時間且固定過程中，應多次更換新的固定液，骨組織标本經骨組織病理(lǐ)切割機分(fēn)切後 ，應該繼續固定至少 12 h， 以使組織标本得(de)到充分(fēn)的固定 。（2）因不脫鈣的骨組織标本緻 密緊實 ，應在抽真空負壓的條件下進行骨組織标本的脫水、浸潤處理(lǐ)，以使組織标本脫水充分(fēn)，樹脂包埋液浸潤更加完全，更利于後續的組織切片制備。（3）進行光聚合固化包埋時，應先利 用幹燥滲透聚合裝置抽真空 ，排淨包埋模具内殘存的氣泡，以 免影(yǐng)響組織塊的聚合、固化。（4）平行粘片制作過程中應利用磨 片機充分(fēn)對需要觀察的組織切面抛光處理(lǐ)，以免出現組織切片 厚薄不一現象 。（5）在磨片時，磨盤轉速應設置的盡可(kě)能的低， 以免造成植入的骨修複材料與宿主骨組織脫離(lí)，緻使長入骨修 複材料的新生(shēng)骨組織丢失，影(yǐng)響後期的組織病理(lǐ)學分(fēn)析。

與普通的石蠟包埋法病理(lǐ)組織切片制備方法不同，本研究 采用 Technovit 7200 VLC 光聚樹脂進行骨組織标本光固化包埋，借助 EXAKT 硬組織病理(lǐ)切磨系統制備骨組織标本的不脫 鈣病理(lǐ)組織切片，組織切片制備過程中所用的并不是傳統的病 理(lǐ)切片刀，而是鑲嵌有金剛石的無齒切割帶鋸，以 " 鋸 " 的形式對組織進行切割，制備組織切片 。該方法制備的病理(lǐ)切片最 顯著的特點是不需要對骨組織進行脫鈣處理(lǐ)，可(kě)使骨組織結構 形态保持完好，骨的礦化結構不被破壞，可(kě)用于含金屬、陶瓷、 骨水泥等骨修複材料的臨床前安全性和有效性的骨缺損修複 動物試驗研究[12] 。同時，該技術方法制片過程中不需要剔除植 入到骨組織中的植入物，保持了骨組織與植入物之間原有的組 織結構形态，可(kě)直觀反應結合界面的組織生(shēng)長結合情況，這對 骨缺損修複試驗的組織長入研究具有重要意義，可(kě)用于 3D 打 印多孔洞類材料組織長入等生(shēng)物組織相(xiàng)容性研究[13]。

生(shēng)物材料及醫療器械動物試驗研究的目的是預測其應用 于臨床可(kě)能發生(shēng)的不良反應，是醫療器械臨床前安全性評價必須進行的一項試驗研究[14]。動物試驗研究組織病理(lǐ)學評價是該評價體(tǐ)系中重要的一環，用以确定産品組織相(xiàng)容性，是評價其安全性并判定是否可(kě)以應用于臨床的重要研究手段[15，16] 。樹脂包埋法制備病理(lǐ)組織切片無需進行脫鈣處理(lǐ)，在動物試驗研究中結合動物活體(tǐ)親骨熒光素标記技術，可(kě)實現動态測量骨修複過程中的新生(shēng)骨礦化率和礦化速率 ，進行骨形态計(jì)量學研究[17，18] 。制備的病理(lǐ)組織切片最顯著的特點是不破壞植入到骨組織中的植入物，保持了骨組織與植入物之間原有的組織結構 形态，該技術方法結合掃描電鏡技術，可(kě)實現觀察成骨細胞在骨修複材料表面及孔隙内附着及生(shēng)長情況，從(cóng)而判斷骨修複程 度，同時結合掃描電鏡技術可(kě)實現觀察骨修複材料表面侵蝕及 骨質沉積情況的研究[19-22]。

20 世紀 80 年(nián)代，爲研究骨組織的礦化程度及新骨形成情 況，塑料包埋技術開始應用于骨組織病理(lǐ)切片的制備，近年(nián)來(lái)許多實驗室在塑料包埋方法上進行了創新，特别是在包埋聚合 液及其聚合條件方面做了多種改進[23-26] 。有文獻報道用甲基丙 烯酸甲酯（MMA）及鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）爲滲透劑，甲基丙烯酸甲酯爲包埋劑，包埋聚合制備骨組織塑料包埋切片的技術方法，但(dàn)這一制片技術因操作煩瑣，制作周期長，且塑料包埋 塊制備過程複雜，組織切片制備過程對溫度要求高，目前該技術方法仍然在用，但(dàn)未得(de)到廣泛應用[27，28]。本研究制備不脫鈣骨組織病理(lǐ)切片包埋劑采用的是光聚樹脂，通過黃(huáng)光與藍光共同輻照(zhào)完成組織包埋塊的包埋聚合 ，與傳統的 " 石蠟包埋組織切片 " 方法及 " 塑料包埋技術 " 組織切片方法制備骨組織病 理(lǐ)切片所用的包埋劑不同 ，組織标本的浸潤處理(lǐ)及切片方式 也不同。

本研究制備的含骨修複材料腰椎椎體(tǐ)不脫鈣病理(lǐ)組織切片，光學顯微鏡下可(kě)清晰觀察骨缺損部位植入骨修複材料後組 織結合界面骨的各種組織細胞結構，可(kě)進行骨缺損修複後骨組 織重建進程及炎症反應研究，适用于生(shēng)物材料及醫療器械臨床前動物試驗安全性評價的組織病理(lǐ)學研究。